活性試劑盒是一種利用熒光探針進(jìn)行活性氧檢測(cè)的試劑盒。本身沒有熒光，可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

 

　　活性試劑盒裝載探針對(duì)于刺激時(shí)間較短，通常為2小時(shí)以內(nèi)的細(xì)胞，先裝載探針，后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞刺激時(shí)間較長(zhǎng)，通常為6小時(shí)以上的細(xì)胞，先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，后裝載探針。

 

　　原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1∶1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

 

　　收集細(xì)胞后裝載探針：按照1∶1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細(xì)胞濃度為一百萬(wàn)至二千萬(wàn)/mL，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘。每隔3～5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。直接用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞，或把細(xì)胞等分成若干份后刺激細(xì)胞。通常活性氧陽(yáng)性對(duì)照在刺激細(xì)胞20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。